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PCR技术的原理与方法
编辑:雁枫 [ 2012-8-21 15:37:04 ] 文章来源:教育装备在线
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PCR定义
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增任何目的DNA?捎糜诨蚍掷肟寺,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面。

PCR技术的基本原理
一.PCR反应成分:
1.模板DNA;2.引物;3.四种脱氧核糖核苷酸;
4.DNA聚合酶;5.反应缓冲液、Mg2 等。
二.PCR反应基本步骤:
1.变性:高温使双链DNA解离形成单链(94℃,30s)。
2.退火:低温下,引物与模板DNA互补区结合(55℃,30s)。
3.延伸:中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应(70~72℃,30~60s)

1.变性(denaturation):通过加热使模板DNA的双链之间的氢键断裂,双链分开而成单链的过程。
2.退火(annealling):当温度降低时,引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子。
3.延伸(extension):在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2 存在下,DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链。
以上述三个步骤为一个循环,每一循环的产物均可作为下一个循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2n的形式增加。

PCR扩增的基本方法


•PCR反应的成分和作用
总体积:一般为25μl~100 μl
(一)无Mg2 buffer:由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值,使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度,但不能超过50 mmol/L,否则会抑制DNA聚合酶活性。
(二)Mg2 :终浓度为1.5~2.0mmol/L,其对应dNTP为200 μmol/L,注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系,由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ,当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。 Mg2 能影响反应的特异性和产率。
(三)BSA:一般用乙;腂SA,起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用,对Taq酶有;ぷ饔。
(四)底物(dNTPs):dNTPs具有较强酸性,其储存液用NaOH调pH值至7.0~7.5,一般存储浓度为 10 mmol/L,各成份以等当量配制,反应终浓度为20~200μmol/L。高浓度可加速反应,但同时增加错误掺入和实验成本;低浓度可提高精确性,而反应速度会降低。
(五)Taq酶:能耐95℃高温而不失活,其最适pH值为8.3~8.5,最适温度为75~80℃,一般用72℃。能催化以DNA单链为模板,以碱基互补原则为基础,按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端,合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性,没有校正功能。某种dNTP或Mg2 浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5~5个单位/100μl。
(六)模板:PCR对模板DNA的纯度不要求很高,但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在,如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。
模板DNA的量不能太高,否则扩增可能不会成功,在此情况下可适当稀释模板。
(七)引物:引物浓度一般为0.1~0.5μmol/L,浓度过高会引起错配和非特异扩增,浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般15~30个碱基,引物过长或过短都会降低特异性。其3’末端一定要与模板DNA配对,末位碱基最好选用A、C、G(因T错配也能引发链的延伸)。
引物G C约占45~55%,碱基应尽量随机分布,避免嘧啶或嘌呤堆积,两引物之间不应有互补链存在,不能与非目的扩增区有同源性。

•PCR反应条件的选择(影响因素)
•温度参数:
1.变性:模板变性完全与否是PCR成功的关键,一般先于94℃(或95℃)变性3~10min,接着94℃变性30~60s。
2.退火:退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15~25bp可通过公Tm=(G C)×4℃ (A T)×2℃计算退火温度,一般退火温度在40~60℃之间,时间为30~45s。如果(G C)低于50%,退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性。

3.延伸:延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内,一般在70~75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定,通常对于1kb以内的片段1min是够用的。
循环数:
PCR的循环数主要由模板DNA的量决定,一般20~30次循环数较合适,过多的循环数会增加非特异扩增产物,具体要多少循环数可通过预试验确定。
PCR产物积累规律:
反应初期产物以2n呈指数形式增加,至一定的循环数后,引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡,产物进入一个缓慢增长时期(“停滞效应”),即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关。 
 

PCR扩增仪

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